CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為新一代基因編輯工具，因其構(gòu)建方便、設(shè)計靈活，操作簡單、效率高成本低，成為基因敲除的新一代利器。該系統(tǒng)由有DNA切割活性Cas9蛋白和識別特異靶點的sgRNA組成。Cas9是一種核酸內(nèi)切酶，它和sgRNA構(gòu)成的復(fù)合體能與DNA分子上的特定序列結(jié)合，并在PAM序列(幾乎存在于所有基因)上游切斷DNA雙鏈。DNA被切斷后，細胞會啟動DNA損傷修復(fù)機制，造成基因的缺失、移碼、插入等隨機突變模式，達到修復(fù)雙鏈斷裂的目的，同時造成靶向基因敲除。
CRISPR/Cas9：穩(wěn)定細胞系構(gòu)建服務(wù)流程
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內(nèi)容 |
詳細信息 |
服務(wù)周期 |
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gRNA 設(shè)計合成及載體構(gòu)建 |
gRNA 設(shè)計及合成 、載體構(gòu)建、質(zhì)粒測序及制備 |
2-3 周 |
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轉(zhuǎn)染 |
慢病毒侵染 |
2-3 周 |
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單克隆細胞制備 |
單克隆細胞稀釋培養(yǎng)、篩選、PCR鑒定、獲得基因敲除單克隆細胞株 |
5-8 周 |
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鑒定 |
測序鑒定 |
2-3 周 |
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送貨 |
提供項目COA、穩(wěn)定克隆 |
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案例展示：
1．構(gòu)建慢病毒載體的crispr sgRNA的單質(zhì)粒系統(tǒng)。
2．經(jīng)過293T細胞轉(zhuǎn)染，包裝得到慢病毒。
3．通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式感染目的細胞。
4．通過抗生素篩選和單克隆挑取后，擴大培養(yǎng)。
5．經(jīng)挑取單克隆細胞后，提取得到單克隆細胞的基因組DNA，再通過PCR擴增目的基因編輯位點的上下游區(qū)段，經(jīng)過TA克隆連接到PMD19T的載體上，進行測序驗證，選取10個菌落測序鑒定得到單克隆的細胞是否單一。
下圖是交付給客戶的單克隆細胞驗證結(jié)果：
T7E1酶切法突變體檢測試驗檢測CRISPR/Cas9的編輯效率：
賽爾瑞成采用T7E1酶切法突變體檢測試驗檢測CRISPR/Cas9的編輯效率。若sgRNA有效編輯了基因組DNA，則目的基因在修復(fù)后會出現(xiàn)堿基缺失突變現(xiàn)象，通過分析T7E1酶處理目標DNA片段的雜合鏈后的情況，從而驗證Cas/sgRNA的編輯效率，用于篩選編輯效率高的sgRNA。
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