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產(chǎn)品概述 
T4 DNA Ligase催化雙鏈DNA或RNA上相鄰的5'-磷酸末端和3'-羥基末端形成磷酸二酯鍵。該酶不僅能夠催化平齊末端或粘性末端之間的連接，還可以修復(fù)雙鏈DNA、RNA或DNA/RNA 雜交雙鏈中的單鏈切刻。 

產(chǎn)品組分 
T4 DNA Ligase (Rapid) (2000 U/μl)

來源 
克隆有來自T4噬菌體DNA Ligase基因的重組E. coli菌株。

保存條件 
-30 ~ -15℃保存，≤0℃運(yùn)輸。 

單位定義 
1單位指在50 μl 1 × T4 DNA連接酶反應(yīng)緩沖液中，23℃反應(yīng)條件下，30分鐘能使50% 的經(jīng)HindⅢ消化的λDNA片段(100 ng)連接所需的酶量。 

反應(yīng)緩沖液 
2× Rapid Ligation Buffer 
132 mM Tris-HCI pH 7.6 @ 25°C 
20 mM MgCl2 
2 mM DTT 
2 mM ATP 
15% PEG 6,000 
10 × T4 DNA Ligase Buffer 
500 mM Tris-HCI pH 7.6 @ 25°C 
100 mM MgCl2 
50 mM DTT 
10 mM ATP 

注意事項(xiàng) 
1. 建議插入片段與載體的摩爾比應(yīng)在3:1 - 10:1。 
2. 平末端載體與片段進(jìn)行連接時(shí)，應(yīng)首先將載體進(jìn)行去磷酸化處理，防止其自身環(huán)化。 
3. dA-Tailing產(chǎn)物與DNA Adapter的摩爾濃度比在1:10 - 1:20。 
4. T4 DNA Ligase不穩(wěn)定，使用時(shí)冰上操作，用完立即放回-20℃。 

實(shí)驗(yàn)案例1: DNA片段和載體DNA的連接 
1. 在微量離心管中配制如下連接反應(yīng)體系: 

a. 插入片段與載體的摩爾比應(yīng)在3:1 - 10:1。 
b. 平末端載體與片段進(jìn)行連接時(shí)，應(yīng)首先將載體進(jìn)行去磷酸化處理，防止其自身環(huán)化。

2. 16°C過夜反應(yīng) 
3. 轉(zhuǎn)化 
4. 將連接產(chǎn)物加入到100 μl感受態(tài)細(xì)胞中(連接產(chǎn)物的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的1/6)，輕輕彈勻，冰上孵育30 min。 
5. 將離心管置于42°C水浴，不要晃動(dòng)，準(zhǔn)確熱激90 sec后，立刻置于冰水浴中，靜置2 - 3 min。 
6. 向離心管中加入900 μl LB或SOC培養(yǎng)基，150 rpm，37°C振蕩培養(yǎng)45 min，使菌體復(fù)蘇，抗性基因表達(dá)。 
7. 5,000 rpm(2,500 × g)離心5 min，去掉900 μl上清。用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸，用無菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。室溫正置10 min。 
8. 待菌液被平板吸收后，37°C倒置培養(yǎng)過夜。 
▲如果使用超級感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化效率>10⁸ cfu/μg)，可直接吸取100 - 200 μl孵育后的菌液涂板。剩余菌液可在4°C保存，一周之內(nèi)都可重新涂板。 

實(shí)驗(yàn)案例2: DNA文庫構(gòu)建中接頭連接反應(yīng) 
1. 在微量離心管中配制如下連接反應(yīng)體系: 

用移液器輕輕吹打混勻 
a. 產(chǎn)物為5'端磷酸化，3'端帶dA的DNA片段。 
b. dA-Tailing產(chǎn)物與DNA Adapter的摩爾濃度比在1:10 - 1:20。 

2. 在PCR儀中進(jìn)行連接反應(yīng): 

反應(yīng)結(jié)束后，立即進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。