◆ 細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥（即生物安全柜）
◆ 培養(yǎng)箱（通用推薦：濕式二氧化碳培養(yǎng)箱）
◆ 離心機(jī)
◆ 醫(yī)用冰箱（4℃）和冰柜（-20℃）、生物超低溫冰箱（-80℃）、液氮冷凍罐
◆ 倒置顯微鏡
◆ 無菌工作區(qū)域：細(xì)胞培養(yǎng)實驗室的主要要求是需要維持細(xì)胞培養(yǎng)操作工作區(qū)域處于無菌狀態(tài)，最簡單經(jīng)濟(jì)的方式就是使用細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥。
◆ 無菌試劑和培養(yǎng)基：商品化試劑和培養(yǎng)基經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制以確保無菌，注意操作過程中不要被污染，其他試劑和溶液需要選擇適當(dāng)?shù)臏缇椒ǎɡ纾焊邏赫羝?、無菌過濾等）進(jìn)行滅菌。
◆ 無菌操作：要求操作人員在實驗開始前對工作區(qū)域和雙手操作部分進(jìn)行75%酒精消毒；盡量使用一次性塑料吸管進(jìn)行單次操作，避免交叉污染；試劑瓶和培養(yǎng)用具使用時方可開蓋，用后要第一時間蓋上，暴露于環(huán)境中的時間盡可能要短。
◆ 整體的細(xì)胞實驗環(huán)境也彌足重要，需要定期對實驗室環(huán)境進(jìn)行較為徹底的清掃消毒和殺菌，包括實驗用儀器和室內(nèi)地面、桌面等。
1. 在細(xì)胞狀態(tài)不足以滿足實驗需求或者出現(xiàn)細(xì)胞污染的情況下，需要進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇：
2. 從超低溫冰箱或者液氮中取出自保存或商品化購買的凍存細(xì)胞后，快速轉(zhuǎn)移至37℃水浴條件下輕輕轉(zhuǎn)動融化（一分鐘內(nèi)）。
3. 75%酒精擦拭凍存管外部后，轉(zhuǎn)移至通風(fēng)櫥中。
4. 加入適量新鮮的完全培養(yǎng)基混合，約800-1000rpm下離心5-10分鐘，實際離心速度時間取決于細(xì)胞種類和細(xì)胞狀態(tài)。
5. 新鮮培養(yǎng)基重懸后接種于相應(yīng)的培養(yǎng)器皿中，做好標(biāo)記，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。
1. 為現(xiàn)有細(xì)胞系做細(xì)胞儲備，需要對代數(shù)相對靠前的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)和細(xì)胞凍存：
2. 準(zhǔn)備細(xì)胞凍存液，置于2℃-8℃下備用。
觀察待凍存的細(xì)胞，密度達(dá)到80%-90%左右，將貼壁/懸浮細(xì)胞分別按照傳代方法收集。
3. 使用血球計數(shù)板對細(xì)胞密度進(jìn)行大致估算后，計算出凍存溶液的體積，從而保證單支凍存細(xì)胞有足夠的細(xì)胞量用于復(fù)蘇。
4. 約800-1000rpm下離心5-10分鐘，無菌條件下小心棄去培養(yǎng)基，不要攪動細(xì)胞沉淀。
5. 用合適體積的預(yù)冷后凍存液重新混懸細(xì)胞沉淀，分裝至凍存管中，做好標(biāo)記后進(jìn)行梯度降溫至液氮環(huán)境中保存，入庫。
無血清細(xì)胞凍存液對比含血清細(xì)胞凍存液的優(yōu)勢
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通用細(xì)胞凍存液 |
Cellregen 無血清細(xì)胞凍存液 |
無血清低 DMSO 細(xì)胞凍存液 |
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主要成份 |
含血清、含 DMSO |
不含血清，含 DMSO 10% |
不含血清，低 DMSO 5% |
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細(xì)胞毒性 |
高 |
高 |
低 |
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安全性 |
低 動物來源病毒、霉菌和支原體等污染的風(fēng)險偏高 |
高 無動物來源病毒、霉菌和支原體等污染的風(fēng)險 |
高 無動物來源病毒、霉菌和支原體等污染的風(fēng)險 |
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凍存細(xì)胞種類 |
適合含血清細(xì)胞凍存 |
通用型 適合各類細(xì)胞凍存 |
通用型 適合各類細(xì)胞凍存 |
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無血清培養(yǎng)細(xì)胞生長狀態(tài) |
易改變易由懸浮狀態(tài)回復(fù)貼壁狀態(tài) |
保持懸浮培養(yǎng)狀態(tài) |
保持懸浮培養(yǎng)狀態(tài) |
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批次差異 |
批次差異大 |
無批次差異 |
無批次差異 |
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操作方法 |
步驟繁瑣 需程序降溫凍存 |
簡單快捷 一步凍存 -80 ℃冰箱 |
簡單快捷 一步凍存 -80 ℃冰箱 |
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保存設(shè)備 |
要求高（液氮） |
要求低（ -80℃ 冰箱） |
要求低（ -80℃ 冰箱） |
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微量凍存 |
細(xì)胞易死亡，存活率偏低 |
細(xì)胞存活率高 |
細(xì)胞存活率高 |
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原位凍存 |
不可行 |
可行，且方便快捷 如 : 雜交瘤細(xì)胞孔板凍存 |
可行，且方便快捷 如 : 雜交瘤細(xì)胞孔板凍存 |
◆ 細(xì)胞的復(fù)蘇中，如細(xì)胞對溫度比較敏感，可將生長培養(yǎng)基預(yù)熱至37℃后再加入融化后的細(xì)胞凍存液中混勻。
◆ 將復(fù)蘇的細(xì)胞高密度接種，如兩支凍存細(xì)胞接種到一個孔板中，可有效提高復(fù)蘇效率。
◆ 細(xì)胞凍存，在加入凍存液進(jìn)行分裝的過程中，要不時輕輕混合細(xì)胞，使其保持均勻的細(xì)胞懸液狀態(tài)，更有利于保證細(xì)胞的凍存效果。
1. 當(dāng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞密度達(dá)到80%左右即可細(xì)胞的傳代操作，從培養(yǎng)器皿中吸棄原有的細(xì)胞生長培養(yǎng)基。
2. 使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液輕輕潤洗細(xì)胞（緩沖液用量根據(jù)培養(yǎng)器皿的表面積調(diào)整），避免攪動細(xì)胞，前后輕晃動器皿數(shù)次。
3. 吸棄緩沖液，重復(fù)潤洗一次。
4. 向培養(yǎng)器皿中加入適量的預(yù)熱解離劑（如胰蛋白酶等），充分覆蓋細(xì)胞層，輕輕晃動容器數(shù)次。
5. 將培養(yǎng)器皿在室溫下孵育2-5分鐘。實際孵育時間實際根據(jù)細(xì)胞系的種類不同而定。6. 移至倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞解離情況，可輕輕拍打器皿壁沿以加快細(xì)胞解離。
7. 當(dāng)細(xì)胞解離程度大于90%，加入三倍于解離液體積的生長培養(yǎng)基中止解離過程，輕輕晃動后吹打細(xì)胞，收集至無菌離心管中。
8. 約800-1000rpm下離心5-10min，實際離心速度時間取決于細(xì)胞種類和細(xì)胞狀態(tài)。
9. 棄去含解離劑的上清溶液，用最少體積的生長培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，混勻后取出少量使用血球計數(shù)板計算細(xì)胞數(shù)量。
10. 將細(xì)胞懸液稀釋到該細(xì)胞系推薦的接種密度，并將適量體積的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的細(xì)胞培養(yǎng)器皿中放回培養(yǎng)箱。
1. 當(dāng)細(xì)胞生長至適合傳代（即處于對數(shù)生長期而未達(dá)到聚合的狀態(tài)）時，從培養(yǎng)瓶中吸取出少量的細(xì)胞樣品，如有細(xì)胞已部分沉淀，要先輕輕晃動培養(yǎng)瓶使細(xì)胞處于均勻的懸浮狀態(tài)后再取樣。
2. 使用血球計數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。
3. 計算將細(xì)胞稀釋到推薦接種密度所需要的加入的培養(yǎng)基體積，如有必要，可先對培養(yǎng)瓶中細(xì)胞進(jìn)行離心收集（800-1000rpm、5-10min）后再重懸計數(shù)和接種。
4. 在無菌狀態(tài)下將適量預(yù)熱的生長培養(yǎng)基加入培養(yǎng)瓶中，必要時可將培養(yǎng)的細(xì)胞分散接種到多個培養(yǎng)瓶中。
5. 將培養(yǎng)瓶的旋蓋外旋一圈，便于進(jìn)行充分的氣體交換（或者使用透氣性瓶蓋），并將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
◆ 貼壁細(xì)胞在進(jìn)行解離（消化）過程中，如果室溫下效果不理想，可轉(zhuǎn)移至37℃培養(yǎng)箱中加快該過程，但要注意控制時間，每30秒需要鏡檢一次。
◆ 細(xì)胞在緩沖液潤洗過程中要盡量完全徹底，培養(yǎng)液中的血清殘留會影響消化效果。
◆ 為了減少細(xì)胞碎片和無用的代謝副產(chǎn)物在培養(yǎng)液中累積，每三周或者必要時都應(yīng)將懸浮細(xì)胞收集起來進(jìn)行一次離心重懸再接種，具體操作等同于正常的傳代培養(yǎng)。
◆ 通常情況下，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中所需添加特定的生長依賴因子，盡量按照“現(xiàn)用現(xiàn)添加”的原則，從而保證培養(yǎng)基中該物質(zhì)的濃度足夠滿足細(xì)胞的生長需求。
