親和層析是利用生物分子間專一的親和力而進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。抗體與抗原、激素與受體、酶與底物等這些生物大分子之間因存在這種特異性親和力，常常一種分子作為配基，制備成親和層析介質(zhì)，用來(lái)純化對(duì)應(yīng)的目標(biāo)分子，這種方法稱為親和層析法。具體來(lái)講，親和層析法即是將配基固定于惰性載體上，混合物中的目標(biāo)蛋白與配基特異性結(jié)合，從而被捕獲，無(wú)關(guān)的雜質(zhì)組分隨著流動(dòng)相被沖洗下來(lái)，然后選擇合適的洗脫液講目標(biāo)蛋白從載體上洗脫下來(lái)，從而得到單一組分的純化物質(zhì)。
抗體親和層析
蛋白A、蛋白G和蛋白L是科學(xué)家陸續(xù)發(fā)現(xiàn)能夠與抗體進(jìn)行特異性結(jié)合的蛋白分子。
圖1. 抗體親和層析示意圖
目前蛋白A及其衍生的重組蛋白、蛋白G已廣泛應(yīng)用于抗體的純化。隨著我國(guó)抗體藥物和免疫診斷產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，抗體制備量將大幅提升，市場(chǎng)對(duì)蛋白 G、蛋白 A 的需求量會(huì)迅速增加。
蛋白A
蛋白A是一種來(lái)源于金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁表面蛋白，能夠與免疫球蛋白特異性結(jié)合，廣泛用于抗體的檢測(cè)和純化。
天然蛋白A結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不耐酸堿，分子內(nèi)部不存在二硫鍵，擁有5個(gè)高度同源的區(qū)域，與IgG有結(jié)合作用。在SPA的5個(gè)結(jié)構(gòu)域中，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都由58個(gè)氨基酸組成三個(gè)α反向螺旋，三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。蛋白A與多種來(lái)源的IgG都有很強(qiáng)的親和力，結(jié)合位點(diǎn)位于IgG的Fc段，不影響IgG結(jié)合抗原的活性。目前，以蛋白A為親和配基的親和層析介質(zhì)已廣泛應(yīng)用于單克隆抗體和Fc重組融合蛋白的純化。
由于層析柱在使用時(shí)，因樣品中變性的蛋白、脂類、DNA等物質(zhì)常殘留在層析介質(zhì)中，嚴(yán)重影響了層析介質(zhì)的使用壽命，常采用0.1-0.5M的氫氧化鈉進(jìn)行清洗，而天然或普通的重組蛋白A對(duì)氫氧化鈉并不耐受，往往導(dǎo)致蛋白A的變性和脫落。
賽爾瑞成通過(guò)基因重組改造，開(kāi)發(fā)的耐堿蛋白A擁有四個(gè)IgG功能結(jié)合域，末端帶有巰基，具有高耐堿性、高親和力的特點(diǎn)，可作為配基制備成耐堿蛋白A親和層析介質(zhì)。
圖2. 耐堿蛋白A 經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)純度>95%
表1.耐堿蛋白A親和層析介質(zhì)耐堿性能測(cè)試
蛋白A對(duì)免疫球蛋白IgG亞型的結(jié)合是有選擇性的，例如在人IgG 的四種亞型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中，蛋白A唯獨(dú)不與IgG3結(jié)合。在與IgA結(jié)合中，只與IgA2結(jié)合，不結(jié)合IgA1。蛋白A不結(jié)合禽類血清IgG。
蛋白G
1973 年，瑞典的科學(xué)家 Kronvall 研究發(fā)現(xiàn)，鏈球菌細(xì)胞壁表面存在能與 IgG 結(jié)合的蛋白，但是并不與 Ig A、Ig M、IgD 和 IgE 有類似的結(jié)合反應(yīng)。1984 年，Bjorck等將這類蛋白統(tǒng)稱為鏈球菌蛋白 G。
蛋白G是一種源自鏈球菌G族的細(xì)胞壁蛋白，分子量25kDa，為三型Fc受體。蛋白G可以與IgG的Fc 區(qū)域特異性結(jié)合，與蛋白A相比對(duì)IgG具有更好的結(jié)合能力，血清蛋白結(jié)合水平更低，純度更高，配基脫落也相對(duì)更低。天然的蛋白 G不僅與免疫球蛋白的恒定區(qū)相結(jié)合,且與白蛋白、α2-巨球蛋白相結(jié)合，這使得用蛋白G親和色譜提純抗體，無(wú)法除去體系中存在的白蛋白和巨球蛋白。
蛋白G的免疫球蛋白結(jié)合區(qū)域主要與IgG的 Fc片段作用，該區(qū)域含有C1、C2、C3 三個(gè)由 55 個(gè)氨基酸組成的單結(jié)構(gòu)域，分別被16個(gè)氨基酸組成的間隔區(qū)域 D1、D2分隔開(kāi)，每一個(gè)單結(jié)構(gòu)域都能夠與抗體IgG的Fc片段結(jié)合。
圖3. 鏈球菌蛋白G的結(jié)構(gòu)
賽爾瑞成開(kāi)發(fā)的重組蛋白G含有三個(gè)與Fc結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，已經(jīng)除去了與白蛋白及細(xì)胞表面結(jié)合位點(diǎn)，減少了交叉反應(yīng)和非特異性結(jié)合。
圖4. 蛋白G經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)純度>95%
表2.蛋白G偶聯(lián)柱料抗體載量
重組蛋白G具有廣泛的結(jié)合譜，可與人、牛、兔、山羊、大鼠和小鼠的多克隆抗體結(jié)合，并且可結(jié)合小鼠 IgG1、IgG2a 和 IgG3 還有大鼠 IgG2a、IgG2b 和 IgG2c等單克隆抗體。重組蛋白G幾乎可與所有哺乳動(dòng)物IgG結(jié)合，只是親和力強(qiáng)弱有所不同。
蛋白L
蛋白L是從馬格努斯消化鏈球菌分離出來(lái)的能和免疫球蛋白特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，分子量36 kD。與蛋白A和蛋白G結(jié)合到（抗體）的Fc區(qū)不同的是，蛋白L能夠結(jié)合那些含有κ輕鏈的抗體，結(jié)合位點(diǎn)位于蛋白L N端的五個(gè)小的同源結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)G結(jié)構(gòu)域非常相似，盡管蛋白質(zhì)G和L沒(méi)有顯著的序列同源性。
蛋白L能夠結(jié)合IgG、IgM、IgA、IgE和IgD，還可以結(jié)合單鏈抗體ScFv和Fab。與蛋白A和蛋白G相比，蛋白L更能廣泛地結(jié)合各種來(lái)源及亞類的抗體，包括人、小鼠、大鼠、兔和雞，但不結(jié)合牛、山羊或綿羊來(lái)源的免疫球蛋白。
賽爾瑞成開(kāi)發(fā)的重組蛋白L，既保留了與抗體κ鏈結(jié)合的特性，同時(shí)也不會(huì)影響抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
附表：Protein A、Protein G、Protein L結(jié)合抗體能力比較
注：+: 表示結(jié)合能力, + 越多, 結(jié)合能力越強(qiáng); -: 表示不結(jié)合; N/A: 無(wú)數(shù)據(jù)
